Apresentação Sumário Bibliografia.htm Equipe Técnica


5 - METODOLOGIAS

5.1 - Ensaios pré-clínicos

Devido à evolução técnico-científica, na década de 80 iniciou-se o desenvolvimento de modelos experimentais alternativos para a área cosmética, em substituição ao uso de animais de laboratório. Metodologias foram desenvolvidas, inicialmente, para responder corretamente as necessidades de pesquisa em farmacologia, onde se sabe que o comportamento animal pode ser diferente do humano. Os métodos alternativos também foram contemplados para a avaliação de efeitos toxicológicos.

Alguns destes métodos vêm sendo utilizados desde tempos remotos, em particular na área da mutagenicidade onde numerosos testes foram desenvolvidos, validados e integrados nas diretivas internacionais tais como a OCDE (Organização para Cooperação e Desenvolvimento Econômico). Também foram utilizados com sucesso para a demonstração de mecanismo de ação específico, sugerindo serem úteis e preditivos no que se refere a sistemas biológicos simples, como por exemplo, nos estudos feitos em microorganismos, células, tecidos e/ou órgãos de animais ou humanos.

A dificuldade no emprego de tais métodos alternativos, hoje, reside na avaliação da reatividade de sistemas mais complexos o que é, na prática, o caso da avaliação de risco toxicológico. É necessário o acesso a uma bateria de testes que sejam complementares, de maneira que o conjunto destes ofereça um resultado com os mesmos níveis científicos e de informação, em relação aos obtidos, anteriormente, com os modelos em animais. Tais modelos alternativos devem ser, portanto, validados, de acordo com os procedimentos internacionais na área de aplicação para que sejam reconhecidos pelo meio científico e pelos órgãos regulamentadores.

Vários esforços tem sido efetuados para a diminuição do uso e do sofrimento de animais. Em 1984, o Governo Britânico concedeu fundos para o desenvolvimento de métodos alternativos ao FRAME - Fund for Replacement of Animal Medical Experiments que, desde 1983, edita uma revista internacional intitulada ATLA - Alternatives to Laboratory Animals. Em 1994, foi inaugurado o ECVAM – European Committee for Validation of Alternative Methods - instituição da Comissão Européia encarregada de promover e validar técnicas e metodologias destinadas à substituição dos ensaios em animais. Algumas instituições, como CTFA - Cosmetic, Toiletries and Frangrance Association, IRAG - Interagency Regulatory Alternatives Group, FDA - Food and Drug Administration e Alternatives to Animal Testing, John Hopkins University, Baltimore - USA, são referências para acelerar a padronização e a harmonização de metodologias
in vitro.

Os 3 R's

A idéia de ensaios alternativos é muito mais abrangente do que a substituição do uso de animais, incluindo também a questão da redução e refinamento na utilização dos mesmos. Este princípio está baseado no conceito dos 3R's (Three R's), o qual foi definido por William Russell e Rex Burch, em 1959, no livro Principles of Human Experimental Technique. Os 3 R's que representam o refinamento, redução e substituição (Refine, Reduction e Replacement) têm como estratégia, uma pesquisa racional minimizando o uso de animais e o seu sofrimento, sem comprometer a qualidade do trabalho científico que está sendo executado visualizando, futuramente, a total substituição de animais por modelos experimentais alternativos.

Refinamento

O Termo refinamento significa a modificação de algum procedimento operacional com animais, objetivando minimizar a diminuição da dor e o estresse. A experiência da dor e do estresse tem, como resultado, mudanças psicológicas que aumentam a variabilidade experimental dos resultados. O interesse dos cientistas é assegurar que as condições ambientais para os animais sejam as melhores possíveis. Os testes considerados menos invasivos podem ser utilizados para diminuir a angústia causada durante o estudo. Além disto, é importante que toda a equipe envolvida seja bem treinada e competente no que se refere a correta atitude em relação aos animais.

Redução

A concepção de redução como alternativa estratégica, resulta em menor número de animais sendo utilizados para obter a mesma informação, ou maximização da informação obtida por animal. Existem várias possibilidades para redução do uso de animais. Alguns laboratórios alertam todos os pesquisadores quando as pesquisas levam o animal a morte. Assim, é dado preferência para pesquisas que utilizem os vários órgãos de um mesmo animal, associadas aos dados apropriados e princípios estatísticos.

Em outros casos, pode-se executar um estudo piloto indicando se o procedimento será apropriado para um estudo maior. Para tanto é possível a utilização de estudos preliminares in vitro, os quais podem indicar novos caminhos, utilizando técnicas não invasivas.

Substituição

Um sistema experimental que esteja vinculado à totalidade da condição de vida animal, pode ser considerado como substituto alternativo. Pode-se citar a proposta de obtenção de células, tecidos ou organismos para subseqüentes estudos in vitro ao invés da matança de animais.

Portanto, verifica-se que alguns métodos alternativos, podem ser utilizados na total substituição em estudos animais e outros, podem complementar dados, auxiliando na redução de utilização de animais empregados em todo projeto. O maior ímpeto de desenvolvimento para testes alternativos tem sido determinado pela indústria farmacêutica. Este investimento tem conduzido para o desenvolvimento adequado da triagem dos componentes para avaliação de potencial toxicológico e eficácia. A utilização da informática, as informações sobre matérias-primas, técnicas físico-químicas, cultura de células, tecidos e órgãos, contribuem para um banco de informações, evitando a duplicação desnecessária de trabalho com animais.

5.1.1 - Critérios a serem avaliados

Os riscos a serem avaliados para ingredientes e produtos cosméticos são do tipo irritativo, alergênico e sistêmico, este último, essencialmente por meio de sua absorção oral ou permeação.

Vários testes desenvolvidos foram aceitos e utilizados na avaliação do risco irritativo. Entretanto, nem todos estão validados até o presente momento, uma vez que os resultados obtidos foram divergentes entre os laboratórios. Baseando-se num banco de dados consistente qualquer pesquisador treinado pode, no entanto, interpretar os resultados obtidos para a comparação entre produtos da mesma categoria. Esses modelos citados, a seguir, só podem ser contemplados como
modelos experimentais de “triagem”, ou seja, de caráter preliminar.

Avaliação do potencial de irritação ocular


Através de um conjunto de métodos in vitro (HET-CAM, BCOP, Citotoxicidade pela difusão em gel de agarose, Citotoxicidade pelo método do Vermelho Neutro, Citotoxicidade pelo método do MTT, RBC), agrupam-se informações que oferecem subsídios para garantir a segurança do produto a nível ocular. Como há mais de um mecanismo de irritação ocular apenas um ensaio in vitro não é suficiente para uma completa avaliação. O ideal é obtermos dados relacionados à vascularização (Het-Cam), opacidade / permeabilização (BCOP) e citotoxicidade (MTT, RBC).

Avaliação do potencial de irritação cutânea

A utilização do teste de corrosividade com modelo de pele reconstituída já é considerado uma metodologia validada. No entanto, este modelo é mais utilizado em ensaios com ingredientes mas, não atende às necessidades de avaliação de produtos acabados.

Avaliação do potencial fototóxico

O teste de fototoxicidade, através da metodologia (3T3 NRU), é definido como uma resposta tóxica clara depois da primeira exposição da célula com agentes químicos, e posterior exposição à irradiação. No que se refere à avaliação do risco alergênico e fotoalergênico ainda não existem testes in vitro, dispondo-se apenas de um teste, que embora não seja considerado como metodologia in vitro, contribui na redução do número de animais de laboratório.

Apresentadas as considerações, citamos resumidamente os testes:

5.1.2 - Ensaios in vitro

HET-CAM (membrana corioalantóide)

O objetivo do ensaio é avaliar semi-quantitativamente o potencial irritante de um produto (produtos solúveis, emulsões, géis e óleos), sobre a Membrana Cório-Alantóide de ovo embrionado de galinha, no décimo dia de incubação. O ensaio é baseado na observação dos efeitos irritantes (hiperemia, hemorragia e coagulação), após 5 minutos da aplicação do produto, puro ou diluído, sobre a membrana cório-alantóide. Obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados.

BCOP (Permeabilidade e opacidade de córnea bovina)

O objetivo do ensaio é avaliar quantitativamente o potencial irritante de um produto ou de uma substância química após aplicação sobre a córnea isolada de bezerro. O ensaio é baseado na medida da opacidade e da permeabilidade da córnea de bezerro após o contato com o produto teste.

Medida da opacificação córnea - realizada com o auxílio de um opacitômetro, aparelho que determina a diferença de transmissão do fluxo luminoso entre a córnea a ser avaliada, fixando um valor numérico de opacidade.
Medida da permeabilidade córnea - realizada conforme o tempo de contato, adicionando fluoresceína e a densidade óptica é medida em 490 nm. Obtém-se uma escala que considera os fenômenos observados.

Citotoxicidade pelo método MTT

A citotoxicidade é avaliada com a ajuda de um corante vital, MTT ou 3-(4,5 dimethyl thiazole-2yl)-2,5 diphenyl tetrazolium bromide. Os parâmetros de avaliação observados são a porcentagem de morte celular e a IC50 (concentração do produto que inibe 50% do crescimento celular). Não aplicável a produtos insolúveis em água.

Citotoxicidade pela difusão em gel de agarose

Indicado para emulsões e géis com fase contínua aquosa. Aplicação dos mesmos à superfície de um gel de agarose em contato com células de tecido conjuntivo de camundongo da linhagem NCTC – clone 929 (ATCC CCL1) onde, a citotoxicidade é avaliada com a ajuda de um corante vital, o MTT ou Vermelho Neutro, observando-se o diâmetro médio do halo de lise celular revelado pela coloração. O halo reflete a citotoxicidade de um produto testado e a sua capacidade em se difundir no gel de agarose.

Citotoxicidade pela método de vermelho neutro (NRU)

Utiliza-se uma cultura de células SIRC CCL 60 ou outras, adicionadas do corante vital vermelho neutro ou MTT. A captação do corante pelas células viáveis é quantificada por espectrofotometria, através de um leitor automático de microplacas. Método empregado para todo tipo de formulação, exceto aquelas que possuam propriedades fixadoras, como as formulações alcoólicas.

RBC - Red Blood Cell System

Este ensaio permite quantificar e avaliar os efeitos adversos dos tensoativos empregados em xampus, sabonetes líquidos e produtos de higiene sobre a membrana plasmática das hemácias e a conseqüente liberação da hemoglobina (hemólise) e ainda, o índice de desnaturação da hemoglobina, avaliado através de sua forma oxidada, ambos quantificados por espectrofotometria. A relação entre a hemólise e oxidação da hemoglobina fornece um parâmetro de caracterização dos efeitos dessas substâncias in vitro.

Teste de corrosividade

O teste de corrosividade consiste em aplicar o produto sobre uma unidade de epiderme humana reconstruída. A viabilidade celular é avaliada pela medida da atividade mitocondrial, através do corante MTT que forma um precipitado azul (formazan) sobre as células viáveis, quantificado por espectrofotometria.

Teste de fototoxicidade

A base deste teste é a comparação da citotoxicidade de um agente químico testado com ou sem exposição adicional a doses não tóxicas de luz UVA. A citotoxicidade é expressa na determinação da dose dependente que reduz o crescimento celular utilizando-se um corante vital, vermelho neutro.

A concentração de um agente químico testado reflete a inibição da viabilidade celular em 50%, calculada usando-se um modelo adequado de curva que expressa a resposta da curva de concentração.

5.1.3 - Ensaios em animais

A experimentação animal tem servido, ao longo de muitos anos, como um meio de se determinar a eficácia e a segurança de diversas substâncias e produtos, em diversas áreas.

A princípio, qualquer animal pode servir à experimentação, entretanto, tem-se procurado utilizar um modelo que apresente melhor resposta a um determinado
estímulo, seja por sua maior sensibilidade, facilidade de manejo e evidenciação do
efeito ou por sua similaridade anatômica, fisiológica ou metabólica com o Homem.

Na área cosmética, os animais podem ser utilizados para avaliar todos os riscos potenciais envolvidos, seja irritação, alergia ou efeitos sistêmicos a curto e longo prazo.

Os animais de laboratório deverão ser utilizados sempre que não existam métodos alternativos validados que os substituam ou, em casos específicos, após “screening” com métodos in vitro e/ou matemáticos válidos, precedendo dessa forma, os estudos clínicos.

Cabe ressaltar que a utilização de animais deve, obrigatoriamente, seguir os preceitos do rigor científico e da ética que norteiam os desenhos experimentais com modelos biológicos, bem como, as normas de bioterismo preconizadas internacionalmente.

Aspectos éticos na realização de ensaios em animais

Atualmente, apesar de todos os esforços para a redução e substituição de animais de laboratório na experimentação biológica, ainda não nos é possível abandonar a utilização desses animais na avaliação da segurança de produtos, nos seus mais diversos aspectos. Entretanto, desde que sejamos obrigados a utilizar animais nos ensaios, devemos zelar para que os mesmos não sofram dores ou vivenciem angústias durante o período experimental.

A caracterização da dor ou desconforto nas diversas espécies animais nem sempre acompanha a realidade humana, dessa forma o experimentador deverá estar bem treinado e, conseqüentemente, familiarizado com os diversos sinais indicativos de sofrimento para a espécie com a qual está trabalhando.

Outro aspecto importante diz respeito às condições ambientais a que são submetidos os animais, variando desde o parâmetro macro (sala, temperatura, umidade, ausência de ruído, ciclo claro-escuro, etc) até o micro (dimensão das caixas/gaiolas, troca de cama, número de animais, etc). Todas as regras básicas de bioterismo e manipulação de animais devem, obrigatoriamente, ser observadas.

Embora pareça paradoxal, o uso de anestésicos nem sempre é recomendado, pois pode interferir com a resposta animal. Porém, parâmetros para a finalização humanitária de experimentos, onde os animais demonstram sinais de angústia e desconforto, devem ser observados. Dessa forma, evita-se o sofrimento desnecessário e já torna
possível uma avaliação do desfecho do teste, com base no conhecimento da evolução do quadro objeto de análise.

De uma forma geral, recomenda-se que os animais de laboratório utilizados em experimentação sejam manuseados dentro dos preceitos éticos preconizados pelos Guias Internacionais, de forma a contribuir para o refinamento dos ensaios e a diminuição do sofrimento a que possam ser submetidos durante a realização de ensaios biológicos.

Teste de Comedogenicidade

Segue a metodologia de Kligman e Fulton em 6 coelhos albinos Nova Zelândia de 2,0 a 3,0 Kg. As amostras são diluídas na proporção de 1,0 a 10,0 g. Efetuam-se 15 aplicações (três semanas com cinco aplicações cada) de 1,0 mL da solução teste na parte interna da orelha direita (esquerda –controle). Leituras diárias e 24 horas após a última aplicação, de eritema, edema e presença ou ausência de comedões.

Teste de irritação dérmica primária e cumulativa

Consiste na aplicação única do produto a ser testado no dorso de coelhos. É aplicado um patch oclusivo por 4 horas e, após esse período o produto é retirado. Procede-se a graduação das lesões (eritema e edema), 24 e 72 horas após a aplicação, seguindo a escala de Draize. No caso do ensaio para irritação cumulativa, as aplicações são feitas por um período de 10 dias consecutivos e as graduações são feitas 24 e 72 horas após a última aplicação.

Irritação Ocular Primária

Consiste na aplicação única do produto no saco conjuntival de coelhos, com observações da evolução das lesões em 24, 48, 72 horas e 7 dias após a instilação. São graduadas as alterações de conjuntiva (secreção, hiperemia e quimose), íris (irite) e córnea (densidade e área de opacidade).

Sensibilização Dérmica

São realizadas aplicações tópicas da menor dose não irritante por um período de 3 semanas (fase de indução). Após um período de repouso, procede-se à aplicação tópica da maior dose não irritante (fase de desafio). As reações são graduadas segundo escala específica, com a finalidade de avaliar o potencial de sensibilização. Para ensaios de sensibilização dérmica maximizada, segue-se o mesmo procedimento, porém, com aplicações subcutâneas de adjuvante completo de Freund, para exacerbar a resposta imune.

Determinação da DL50 oral

Visa verificar a toxicidade produzida por uma substância quando administrada por via oral, geralmente forçada, por meio de entubação gástrica (gavage). De uma forma geral, os ensaios se baseiam na contabilidade do percentual de animais que são levados a óbito em determinadas faixas de doses. Recomenda-se, também, observar a ocorrência de sinais e sintomas indicativos de toxicidade (ambulação, piloereção, etc).
Os ensaios de toxicidade aguda estão sendo revistos pelo Comitê Técnico da OECD, no sentido de serem substituídos por avaliações também fidedignas, mas que reduzam o sacrifício ou mesmo o número de animais empregados.

Irritação da mucosa oral
Aplicação do produto na bolsa bucal de hamsters, com lavagem subseqüente,
durante um determinado período. São feitas observações macroscópicas da mucosa da bolsa e, ao final do ensaio, os animais são sacrificados para exame histopatológico das alterações da mucosa.

Fotoalergenicidade

Os ensaios são feitos em cobaias albinas. Se iniciam com uma fase de indução onde o produto é aplicado de maneira repetida em duas áreas do mesmo flanco dos animais, expondo-se à radiação UVA e UVB, em seguida. Após um período de repouso, procede-se à nova aplicação, em outro flanco, em duas áreas, sendo uma delas o controle, sem exposição à radiação. Após 48 horas, são feitas as observações, comparando-se com a área controle, para confirmar que se trata de uma reação fotoalergênica.

Fototoxicidade

Os ensaios são realizados em cobaias albinas. O produto é aplicado na pele do animal, seguido por exposição à radiação UVA e UVB, sendo uma área, controle. Após 48 horas, são feitas observações macroscopicas e, quando necessário, microscopicas, comparando-se com o controle, sem exposição, para correlacionar uma resposta fototóxica.

Irritação da mucosa genital

São utilizados coelhos albinos machos (irritação de mucosa peniana) ou fêmeas (irritação de mucosa vaginal). O produto é aplicado sobre a mucosa com observações macroscópicas e microscópicas das alterações teciduais. São feitas graduações de forma a determinar o potencial de irritação.

5.2 - Ensaios Clínicos

Produtos cosméticos necessitam de ensaios clínicos em humanos, para que as empresas possam oferecer aos consumidores, o máximo de segurança com o menor risco, garantindo as melhores condições de uso do produto. A partir das informações pré-clínicas coletadas, deve haver a comprovação de segurança de uso por humanos. Estas informações são importantes para determinação do modo e local de uso, advertências de rotulagem e orientações para o serviço de atendimento ao consumidor.

Os ensaios de compatibilidade têm por objetivo comprovar a inocuidade dos produtos em pele humana. São realizados de modo geral com apósitos oclusivos ou semi-oclusivos (patch tests) ou em modelos abertos (open tests). Representam o primeiro contato do produto acabado com um ser humano, e por isso devem seguir premissas de ordem ética (levantamento prévio de dados pré-clínicos segundo Resolução 196/96 do MS) e de boas práticas clínicas. Há várias metodologias e critérios de avaliação na literatura.

Ensaios de Compatibilidade:

Irritação Cutânea Primária e Acumulada

Os ensaios devem contemplar um número mínimo de voluntários (50) com critérios de inclusão e exclusão previamente padronizados. O produto é aplicado de forma aberta, semi-oclusiva ou oclusiva, de acordo com o produto a ser avaliado. A duração do contato e periodicidade das leituras são padronizadas. A interpretação dos resultados deve ser feita considerando o ICDRG (international Contact Dermatitis Research Group). A avaliação deve ser feita por dermatologista.

Fotoirritação

Os ensaios devem ter um mínimo de 25 voluntárias com critérios de exclusão e inclusão previamente definidos. Deve haver uma irradiação no sítio de aplicação localizado no antebraço ou no dorso e a interpretação dos resultados também deverá seguir as normas do ICDRG.

Soap Chamber Test

Este ensaio se destina à avaliação de produtos enxaguáveis com duração de contato e periodicidade previamente padronizados, utilizando-se 15 voluntários com pele sensível. A escala para interpretação das leituras é a de Frosch & Kligman, 1979. A avaliação também deve ser feita por dermatologista.

Comedogenicidade

A avaliação de comedogenicidade deve ser realizada em voluntários negros (fototipos 5 e 6) com aplicação no dorso, de forma padronizada, por um tempo de 28 dias, em no mínimo 5 voluntários, para então se proceder com a biópsia com cola de cianoacrilato e a leitura dos achados em microscopia óptica.

Sensibilização Dérmica


Estes ensaios tem as mesmas premissas de compatibilidade, e deve constar de 3 etapas: Indução, Repouso e Desafio realizado com apósitos oclusivos ou semi-oclusivos, em antebraço ou dorso, em no mínimo 50 voluntários e deve ser realizado, por dermatologista, segundo a escala do ICDRG.

Fotossensibilização

A avaliação de fotossensibilização deve também seguir as 3 etapas para indução de sensibilização, mas deve haver irradiação de luz ultravioleta (faixa A) para avaliar seu papel na indução de alergia. O número mínimo de voluntários é de 25, e os ensaios são sempre oclusivos, podendo ser realizados em dorso ou antebraço. A escala de avaliação segue o ICDRG, e deve ser elaborada por dermatologista.

Ensaios de Aceitabilidade:

Os protocolos de aceitabilidade devem obedecer às condições de uso determinadas pelo fabricante, com critérios de inclusão e exclusão padronizados, onde a única variável é o uso do produto. O número de voluntários deve ser de no mínimo 30, com avaliação dermatológica e conforme o caso, subjetiva.

Pode haver acompanhamento de outro profissional médico de acordo com a categoria de produto (pediatra, ginecologista, oftalmologista, etc.). A duração do ensaio e o número de aplicações poderá variar de acordo com a categoria do produto.

Ensaios de Acnegenicidade e Comedogenicidade em uso

Esta avaliação deve ser realizada em indivíduos de pele oleosa e/ou com tendência a acne, com critérios de exclusão e inclusão padronizados. O uso do produto deve ser padronizado de acordo com as orientações do fabricante. A análise inicial e final das condições da pele deve constar da avaliação clínica, cujos critérios são delineados antecipadamente, assim como a contagem das lesões comedônicas e acneicas.

Agência Nacional de Vigilância Sanitária